У чым розніца паміж звычайнай сістэмай ПЦР і ПЦР у рэжыме рэальнага часу?


адказ 1:

Карацей кажучы, прынцып той жа: у вас два праймеры (FW і RV). Яны распрацаваны супраць канкрэтнай мэты альбо супраць прывязкі да некалькіх мэтам, але маюць агульную паслядоўнасць.

У ПЦР у рэальным часе выкарыстанне праймераў спалучаецца з флуарэсцэнтным фарбавальнікам, які звязваецца ў двухстворчатай ДНК (таксама вядомай як сродак інтэркаляцыі, напрыклад, SYBR Green), альбо з зондамі, якія нясуць фторхром і тушыцель. Абодва падыходу (калі вам трэба іх падрабязна ведаць, я растлумачу вам, але я прытрымліваюся асноўнага пытання) дазваляюць кантраляваць узмацненне мэтавай малекулы ДНК на этапе ампліфікацыі ў рэжыме рэальнага часу і забяспечыць следчаму колькасны аналіз .

Чаму гэта карысна?

Што робіць ПЦР? Ён узмацняецца. Кожнае павышэнне падзея называецца цыклам павышэння. Звычайна кругі ўзмацнення за рэакцыю (паміж 25 і 28) падтрымліваюцца ніжэй за 30 цыклаў. Чаму гэта? Паколькі ПЦР выкарыстоўваецца для таго, каб даведацца, ёсць што-небудзь ці не, альбо калі нешта больш-менш прысутнічае ў гэтым стане ў параўнанні з кантролем. Калі крокаў на ўзмацненні занадта шмат, вы не можаце зразумець, ці ёсць нешта на самай справе, альбо вы бачыце сігнал толькі таму, што ў вас ён узмацняецца так часта, што падобна на тое, што ёсць у нейкі момант (розум, гэта я) не варта «вызначыць колькасна», таму што стандартная ПЦР натуральна робіць гэта немагчымым.

Напрыклад, A было менш, чым B. Пачынаецца ўзмацненне і пасля 30 цыклаў вы запусціце гель, і A і B маюць моцны сігнал. Такім чынам, вы кажаце "A = B, няма розніцы паміж кантролем і эксперыментам". Гэтага не здарылася б, калі б вы зрабілі толькі 25 цыклаў. Вы бачыце, што я маю на ўвазе?

Падчас ПЦР у рэжыме рэальнага часу вы можаце бачыць па цыкле, колькі каштуе Amplifcon (узмоцненая нітка) у гэты час за гэты пэўны цыкл. Такім чынам, калі вы запусціце 30 цыклаў і атрымаеце вынік, вы можаце сказаць з папярэдняга цыкла ўзмацнення: "ОК, розніца рэальная" або "Няма розніцы".

Гэта на самай справе працуе з праграмнага забеспячэння. У іх ёсць парог (так што вы можаце бачыць сігнал толькі тады, калі ён перавышае пэўны памер, гэта можа ўсталяваць пісьменнік, абапіраючыся на ўласны вопыт патрэбы). І, як бачыце, колькасць пачынаецца на пласкагор'і вышэй цыкла 30. У гэты момант нельга будзе размяжоўваць рэчы, бо ўсе яны будуць выглядаць аднолькава! З дапамогай праграмнага забеспячэння вы можаце прагледзець усе цыклы і атрымаць агляд таго, што адбывалася цыкл за цыклам.

Я спадзяюся, што гэта дапаможа, калі вам трэба больш падрабязнасцей і тлумачэнняў, проста дайце мне ведаць.


адказ 2:

Вы не пыталіся, але хацеў бы адзначыць, што існуе яшчэ адна колькасная схема ПЦР, якая становіцца ўсё больш папулярнай: лічбавая ПЦР.

Мінусам ПЦР у рэжыме рэальнага часу з'яўляецца тое, што вы не можаце атрымаць сапраўды колькасныя вынікі, не робячы нічога супраць стандартаў. Асноўнай прычынай гэтага з'яўляецца тое, што розныя ампліконы маюць розную эфектыўнасць узмацнення, на што, у сваю чаргу, можа паўплываць змяненне ўмоў рэакцыі (напрыклад, нераўнамернасць кантролю тэмпературы з дапамогай ПЦР-пліты) або забруджванняў узору. Лічбавая ПЦР ліквідуе гэтыя праблемы, ператвараючы ПЦР у бінарную сістэму: узмацненне бачна альбо не.

Лічбавая ПЦР складаецца з правядзення мноства рэакцый ПЦР паралельна з адным і тым жа ўваходным матэрыялам. Хітрасць заключаецца ў развядзенні ўзору так, што чакаецца, што многія рэакцыйныя камеры не будуць атрымліваць малекулы шаблона. Праводзіцца ПЦР, і тады падлічваецца колькасць станоўчых камер. Калі ўставіць гэта ў раўнанні, заснаваныя на размеркаванні Пуасана, вы атрымаеце ацэнку колькасці ўваходных малекул. Паколькі яно заснавана на падліку, лік не залежыць ад стандартнай крывой. гэта проста колькасна.

Шэраг лічбавых сістэм ПЦР былі камерцыялізаваны з выкарыстаннем лунак або кропель для рэакцыйных камер. Яны таксама адрозніваюцца па колькасці камер ПЦР; Кропельныя схемы ўражваюць значна, значна большыя лічбы. Дакладнасць і дынамічны дыяпазон залежаць ад колькасці кропель - з большай колькасцю камер вы можаце быць далей ад вашай першапачатковай ацэнкі канцэнтрацыі.

Розныя схемы прапануюць розныя выдаткі на абсталяванне і просты рабочы працэс. Напрыклад, прыбор Fluidigm цалкам інтэграваны, але, на мой погляд, прапануецца менш за 1000 камер на ўзор, у той час як сістэма BioRad мае асобныя этапы эмульгацыі, узмацнення і падліку (з двума адмысловымі прыборамі; тэрмацыкл працуе ў звычайным тэрмацыклеры) і мае дзясяткі тысяч палатаў.